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系統識別號 U0007-1704200714554171
論文名稱(中文) (-)-Epicatechin在家兔體內之藥物動力學研究
論文名稱(英文) Pharmacokinetic study of (-)-Epicatechin in rabbits
校院名稱 臺北醫學大學
系所名稱(中) 藥學研究所
系所名稱(英) Graduate Institute of Pharmacy
學年度 93
學期 2
出版年 94
研究生(中文) 陳彥安
研究生(英文) Yen-An Chen
學號 M301092014
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期
論文頁數 113頁
口試委員 指導教授-許光陽
中文關鍵字 反兒茶素  藥物動力學 
英文關鍵字 Epicatechin  Pharmacokinetics 
學科別分類
中文摘要 (-)-Epicatechin屬於兒茶素的一種,常存在於綠茶及可可中。(-)-Epicatechin可藉由清除體內自由基達到抗氧化的作用。(-)-Epicatechin已被證明具有抗神經細胞老化、抗癌及降低心血管疾病的發生等作用。雖然(-)-epicatechin有許多藥理活性,但對於(-)-epicatechin的藥物動力學研究仍不甚完善。本實驗之目的即為研究(-)-epicatechin於家兔體內之藥物動力學表現。 利用高效液相層析儀,使用C18的逆相層析管柱,配合螢光偵測器,激發波長及發射波長分別設在280nm、310nm下,偵測兔血漿中的(-)-epicatechin濃度。在血漿濃度20-8000ng/mL的範圍內呈現良好的線性,變異係數皆小於9%。且檢品處理方法簡單-僅除蛋白,其平均回收率為87.11±0.03%。 此分析方法亦成功應用於分析(-)-epicatechin的藥物動力學研究上,以三種不同劑量,5、10、25mg/kg之EC靜脈投與於家兔體內,分析其血中濃度與時間關係,顯示(-)-epicatechin於家兔體內動態符合二室性模式。在排除半衰期與清除率無統計上之差異,排除半衰期分別為51.16±6.42、51.72±5.15、49.99±10.96min;清除率分別為53.62±6.27、53.04±11.07、54.32±10.09mL/min/kg。即(-)-epicatechin在5-25mg/kg的劑量範圍下呈dose-independent之藥物動力學。其曲線下面積分別為94.39±11.77、195.93±42.82、476.74±108.18μg?min/mL,曲線下面積與劑量之關係呈線性。 以腹膜腔投與25mg/kg的(-)-epicatechin,其生體可用率為1.07±0.20,顯示(-)-epicatechin受到肝臟首渡效應的影響不大。而於口服投與(-)-epicatechin,其個體差異性大,其吸收的比率相當低,所得之平均生體可用率為0.04±0.02,其原因可能是由於藥物在腸胃道中的吸收不好或藥品本身溶解度不佳所致。
英文摘要 (-)-Epicatechin is a kind of catechins and commonly presents in green tea and cocoa. (-)-Epicatechin acts as antioxidant by scavenging free radicals. (-)-Epicatechin is also demonstrated with anti-neurodegenerative, anti-cancer effect, and reduced the risk of cardiovascular disease. Although (-)-epicatechin has several pharmacological actions, but the pharmacokinetics of (-)-epicatechin has not studied well. The aims of this study are to investigate the pharmacokinetic property of (-)-epicatechin in rabbits. A high-performance liquid chromatographic method was consisted of a C18 reversed-phase column with fluorescence detector, the excitation and emission wavelengths were set at 280nm and 310nm, for determination of the (-)-epicatechin in rabbit plasma. The calibration curve of plasma sample showed good linearity with the concentration range of 20 to 8000ng/mL. All coefficients of variance were less than 9%. By a simple protein-denature procedure, the average recovery was 87.11±0.03%. Application of this method was successfully assessed I.V. administration of 5,10,25mg/kg dose of (-)-epicatechin in rabbits. The plasma concentration-time profile of (-)-epicatechin colud be fitted with two-compartment model with each dose. There were no significant different in elimination half-life and systemic clearance under these doses. The elimination half-life were 51.16±6.42、51.72±5.15、49.99±10.96min;systemic clearance were 53.62±6.27、53.04±11.07、54.32±10.09mL/min/kg. It indicated that the (-)-epicatechin behaved a dose-independent pharmacokinetics between 5 and 25mg/kg. The area under the curve (AUC) were 94.39±11.77、195.93±42.82、476.74±108.18μg?min/mL. The area under the curve (AUC) were proportional to the dose administered. In addition, 25mg/kg of (-)-epicatehcin was I.P. administrated to rabbit, the first pass effect of (-)-epicatechin was not significant (F=1.07±0.20). After P.O. administration of 50mg/kg (-)-epicatechin, there were great individual variations, and the fraction of absorption was low. The mean absolute bioavailability of (-)-epicatechin was 0.04±0.02. The poor bioavailability may result from poor absorption of (-)-epicatechin in the gastro-intestinal tract or low solubility of (-)-epicatechin.
論文目次 目 錄 頁次 目錄 I. 流程目錄 V. 附表目錄 VI. 附圖目錄 VIII. 中文摘要 IX. 英文摘要 XI. 第一章 緒論 1 一、茶的基本性質 3 1. 兒茶素的結構分類 5 2. 兒茶素的藥理作用. 7 2.1. 自由基的介紹 7 2.2. 外源性自由基和生物體內氧自由基的產生 8 2.3. 自由基所造成的傷害機制 8 2.4. 自由基所誘發的疾病 9 3. 兒茶素清除自由基的作用機轉 10 4. 兒茶素的分析方法 12 5. 兒茶素的代謝 14 二、EC的簡介 16 1. EC的來源. 16 2. EC的物理化學性質 17 3. EC之藥理作用與活性 17 3.1. EC抗氧化即清除自由基的作用 17 3.2. EC降低血中低密度脂蛋白作用 18 3.3. EC與金屬螯合的能力 19 3.4. EC的促進p-glycoprotein功能的作用 19 3.5. EC抑制神經元細胞老化的作用 20 4. 副作用與毒性 21 4.1. 抑制COMT的作用 21 4.2. 抑制對鐵的吸收 21 5. EC的安定性研究 22 6. EC的藥物動力學研究 24 7. EC的代謝與排除研究 26 8. (-)-Epicatechin(EC)與(+)-Catechin(C) 28 三、實驗目的 30 第二章 實驗部分 31 一、實驗材料與儀器 31 1. 實驗試藥 31 2. 儀器 32 3. 試藥之製備 32 3.1. EC儲備溶液之配製 32 3.2. Caffeine儲備溶液之配製 33 3.3. 磷酸溶液之配製 33 二、實驗方法 34 1. 分析條件 35 2. 檢品之處理 36 3. 標準檢量線之製作 38 4. 分析方法之確效試驗 38 4.1. 回內分析 (within-run assay) 之精確性 (precision) 與準確性 (accuracy) 38 4.2. 回間分析 (between-run assay) 之精確性 (precision) 與準確性 (accuracy) 39 4.3. 回收率試驗 (recovery test) 39 5. 安定性試驗 40 5.1. 不同溫度下於血液中之安定性 40 5.2. 不同溫度下於血漿中之安定性 40 5.3. 室溫下於已酸化之血漿中之安定性 40 6. 動物實驗 41 6.1. 實驗家兔之準備 41 6.2. 藥物投與溶液之組成 41 6.3. 靜脈注射EC之藥物動力學實驗方法 42 6.4. 腹膜腔內投與EC之藥物動力學實驗方法 42 6.5. 口服投與EC之藥物動力學實驗方法 43 7. 動物實驗數據之處理 44 7.1. 靜脈注射EC之數據處理 44 7.2. 腹膜腔內投與EC之數據處理 45 7.3. 口服投與EC之數據處理 45 7.4. 腹膜腔內投與和口服投與EC之生體可用率的探討 46 第三章 結果與討論 48 一、分析方法之結果與討論 48 1. 分析方法之比較 50 2. 分析方法之標準檢量線 57 3. 分析方法之確效 57 4. 分析方法之回收率 57 二、安定性試驗之結果與討論 63 1. EC在不同溫度下於血液中之安定性之結果與討論 63 2. EC在室溫下於已酸化之血漿中之安定性之結果與討論 64 三、動物實驗之結果與討論 69 1.靜脈注射不同劑量EC之探討 70 1.1. 靜脈注射不同劑量EC之藥物動力學結果 70 1.2. 靜脈注射不同劑量EC之藥物動力學討論 77 2. 腹膜腔內投EC與之探討 82 2.1. 腹膜腔內投與EC的藥物動力學結果與討論 82 3. 口服投與EC之探討 85 3.1. 口服投與EC的藥物動力學結果與討論 86 4. 腹膜腔內投與和口服投與EC之生體可用率探討 90 5. 口服吸收之探討 92 6. 討論EC與C於藥物動力學的差異 97 第四章 結論 104 參考文獻 107 第一章 緒論 茶是目前世界上最普遍也最廣受歡迎的飲品,喝茶的文化主要流行於亞洲與歐洲,不過有越來越多的人也開始飲用茶品,主要是因為有研究顯示喝茶能預防特定疾病的發生(1)。根據行政院衛生署,對國人十大死因的統計,癌症已連續二十年為國人十大死因之首(2)。目前針對癌症的研究目標也由對癌症的藥物治療進展到如何預防癌症的發生,根據科學統計的資料,茶葉能夠降低癌症及心血管疾病的發生(3),這也使得與茶葉相關的研究越來越受到國內外學者的重視。 追溯起茶的起源,茶源自中國古代,由《神農本草綱目》中可知:「神農嚐百草,日遇七十二毒,得荼而解之」。其中的荼,所指的就是茶,此時茶主要是被當作藥品來使用,直到後來茶才成為人們日常生活中的飲品。現今學者也藉由科學實驗證實,茶具有抗癌、降低心血管疾病的發生、抗基因突變、降低血中膽固醇、抗低密度脂蛋白過氧化、抑制腫瘤生長、抗氧化、抗發炎、抗菌、抗病毒等有益作用(1, 4, 5)。 Figure 1. Taiwan area main causes of death. http://www.doh.gov.tw 一、茶葉的基本性質 茶(tea)學名為Camelli sinensis屬於山茶科(Theaceae),常綠灌木,小枝光滑,嫩芽披毛。單葉,互生,具短柄;葉片長7-15公分,寬3-5公分,橢圓形至長橢圓形,兩端銳尖或先端呈尾狀銳尖,邊緣為鋸齒緣;花單生,白色;富含單寧(Tannin),葉經烘焙可泡成飲料(6)。茶味苦、微寒、無毒。入腎經。具有利小便、去痰熱、止渴、清頭目、除瘴氣、利大小腸、治泄痢、止頭痛等功效(7)。 茶的可溶性成分約佔茶葉乾物重量之30-40%左右,依茶葉之品種、產地、氣候、加工處理(如發酵程度)等等條件有所差異。茶葉中之可溶性成分主要為茶多元酚(tea polyphenols),依其結構差異可分為黃烷醇類(flavanols)、黃酮醇類(flavonols)及其配醣體、無色花青素(leucoanthocyanins)、酚酸(phenolic acid)、氧化態聚合酚類。黃烷醇類(flavanols)又稱為兒茶素(catechins),是茶葉中含量最高的多元酚佔總量的75-80%,包括(-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)、(-)-epigallocatechin (ECG)、(-)-epicatechin (EC)、(-)-gallocatechin (GC)、(+)-catechin (C)、(-)-gallocatechin-3-gallate (GCG)、(-)-epigallocatechin (EGC)、(-)-gallocatechin (GC),以EGCG為主要成分,約佔兒茶素(catechins)的50%(4, 8)。 目前人們常飲用的茶可分為三類:紅茶、烏龍茶及綠茶。紅茶屬於全發酵茶,茶葉在摘採後經過發酵的處理,產生特殊的香味與顏色,其中紅茶的成分包含9%兒茶素(catechins)、4%茶黃素(theaflavins)、15%茶紅素(thearubigin);綠茶屬於未發酵茶,即在製造過程中不經過發酵的過程,直接乾燥。綠茶中含有10-30%的兒茶素;而烏龍茶是屬於半發酵茶,其成分多介於紅茶與綠茶之間(8)。 茶葉中的兒茶素為最主要的生理活性成分,具有抗氧化(9-11)、抗基因突變(12)、防癌(13, 14)、降低膽固醇、降低血液中低密度脂蛋白過氧化(4, 15, 16) 、降血壓、抑制血糖上升、抗菌、抗病毒、腸內微生物相改善(5)等藥效。 1.兒茶素的結構分類 兒茶素在結構上屬於類黃酮素(flavonoids)之一,除了存在於茶葉中,也存在於紅酒、水果與果汁中,依其結構上不同可分為:(-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)、(-)-epigallocatechin (ECG)、 (-)-epicatechin (EC)、(-)-gallocatechin (GC)、(+)-catechin (C)、gallocatechin-3-gallate (GCG)、(-)-epigallocatechin (EGC)、(-)-gallocatechin (GC).等,其結構式如Figure 2.(17)。 Figure 2. Structures of major catechins in tea J. J. Dalluge et al. Determination of tea catechins. J Chromatogr A 881: 411-24 (2000). 2.兒茶素的藥理作用 依據文獻報告兒茶素具有抗氧化、抗基因突變、防癌、降低膽固醇、降低血液中低密度脂蛋白過氧化、降血壓、抑制血糖上升、抗菌、抗病毒、腸內微生物相改善等藥理作用(5)。兒茶素的抗氧化作用是源自清除體內自由基(1, 5, 13),且於文獻証明許多疾病的發生初始都是由於自由基侵犯細胞,產生一連串的氧化反應,製造活性或毒性物質,進一步導致疾病的發生。 2.1.自由基的介紹 自由基(free radical)是指能獨立存在,含有一個或一個以上不成對電子的任何原子或原子團。在化學反應中以及生物體內都會產生自由基。氧在最穩定的狀態稱為基態(ground state)氧。當氧以其他形式存在時,會有一個非常不穩定的情況,必須得到一個電子來達到平衡,以維持自己的穩定,因此會以氧化的方式,與其他原子或化合物競爭電子,這些不穩定的活性氧(reactive oxygen species,ROS)或稱為氧自由基。根據估計人體內所有的自由基中約有95﹪以上屬於氧自由基。而氧自由基往往是其他自由基生成的主因,活性氧或其衍生物因相互競爭電子而導致影響其他分子或化合物的狀態(18-22)。 2.2.外源性自由基和生物體內氧自由基的產生 外源性自由基的產生: 由於外來性刺激,將帶有成對電子的分子、原子或離子轉變為帶有不成對電子的的自由基,產生的自由基稱之為外源性的自由基。因為兩個由成對電子所組成的分子使有高的共價鍵解離能,因此需要從外界得到足夠大的能量才能打破共價鍵成為自由基,而提供能量的方法比如:熱解、光解、輻射分解、金屬離子偶聯的氧化反應以及自由基誘發反應等。熱解:利用熱能使化合物的共價鍵斷裂,將化合物熱解產生自由基的方法。光解:利用光化學反應吸收光量子能使共價鍵斷裂,產生自由基的方法稱為光解。金屬離子偶聯的氧化反應:利用Fenton發現的反應Fe2+和H2O2在室溫下的反應進行而使其他有機物發生一連串作用,而產生自由基,如下圖所示: Fe2+ + H2O2 ? Fe3++ OH- + •OH R + •OH ? R•OH R•OH + Fe3+ ? R-OH + Fe2+ + H+ R•OH + R ? R2OH 內源性自由基的產生: 在生物體內,利用氧氣所產生的自由基稱之為內源性自由基。內源性自由基主要是超氧陰離子(O2-•)或氫過氧基(HO2•)與羥自由基(•OH)及其活性衍生物,如過氧化氫(H2O2)、單態氧O2、氧有機自由基(RO•)、有機過氧基(RO2•)、R-氫過氧化物(ROOH)(20, 21)。 2.3.自由基所造成的傷害機制 在細胞的構造中多處皆可產生自由基:如粒腺體 (mitochondria)、溶小體(lysosome)、細胞膜磷脂質(phospholipid)、內質網(endoplasmic reticulum)等。自由基對於人體有好處亦有壞處,如在吞噬細胞(macrophage)中利用自由基來殺死外來的細胞或病菌。自由基會誘發器官的保護反應,但是自由基過多也會對細胞組織造成傷害(18)。 2.4.自由基所誘發的疾病 當體內的氧化物過多時會導致體內的平衡失調會造成脂質、蛋白質或是DNA損傷而形成疾病,例如癌症、帕金森氏症、高血壓、動脈硬化症、心肌梗塞、血栓形成、血小板凝集等情形產生。自由基會造成傷害與疾病,目前已知自由基會和細胞膜上脂質的不飽和鍵結反應產生脂質過氧化反應,大量形成細胞膜上的脂質過氧化物,如此將導致細胞表面接受器與細胞膜的結合能力變低,而使細胞膜受損。自由基也會損害含硫蛋白及其它蛋白,造成離子傳輸系統(ion transport systems)受損,促使細胞內離子分佈不均,進而使酵素系統失去活性,導致細胞受到傷害或造成蛋白質分解、結構改變或變性等。自由基也會對去氧核糖核酸的鹼基造成傷害,使DNA斷裂、突變、細胞週期改變、甚至具致癌性。自由基對醣類的氧化性傷害能造成細胞表面接受器功能受損,包括對荷爾蒙及神經傳導的反應。除此之外自由基可以氧化不飽和脂肪酸產生醛類如丙二醛(malondialdehyde,MDA) 造成脂肪、蛋白質、核酸間的交互作用。受到自由基攻擊的正常細胞會遭受氧化而損傷,進而誘發其他疾病。與自由基有關的疾病有:粥狀動脈血管硬化症 (atherosclerosis)、糖尿病性腎病變(diabetic nephropathy)、高血壓(hypertension)、腎臟損害、血管栓塞、缺血性心臟疾病、腦中風(stock)、腦缺血、各種癌症(cancer)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis )、自體免疫性疾病以及造成老化的主要因子(20-22)。 3.兒茶素清除自由基的作用機轉 兒茶素屬於類黃酮素(flavonoids)之一。依文獻報告flavonoids是良好的自由基清除劑,其作用如下: 抑制負責產生superoxide anion之酵素,如黃嘌呤氧化酵素(xanthine oxidase)(23, 24)和protein kinase C(25);也會抑制能產生活性氧物質的酵素:如cyclooxygenase、lipoxygenase、microsomal monooxygenase和NADH oxidase等。也因此抑制了superoxide anion、hydroxyl 及peroxy radicals 之生成(26)。如flavonoids 100 μM在體外系統下,可抑制cytochrome P450-mediated 的活化反應,而此cytochrome P450 enzymes 會活化致癌性物質(27)。 部分flavonoids 能夠與金屬螯合,如鐵與銅,而減少氫氧自由基之產生(28)。因鐵與銅會增加活性氧物質的生成,例如將hydrogen peroxide 還原產生氫氧自由基。 H2O2 + Fe2+(Cu+)?˙OH + OH– + Fe3+(Cu2+) 在flavonoids 之B環上之catechol 部分、C環上之3-hydroxyl, 4-oxy group 及C環與A環之間的4-oxy,5-hydroxyl group都可與金屬螯合,其主要鍵結部位還是在B 環之catechol上。 由於flavonoids其抑制與清除自由基之作用,在藥理學上具抗發炎作用、抗過敏作用(anti-allergic action)、增強免疫作用(immunoenhancing effect)、抗腫瘤與anti-HIV能力、抑制致癌作用(carcinogenesis)、鍵結在低密度脂蛋白(low density lipoproteins,LDL)上,避免脂質的過氧化和動脈粥瘤硬化病變(atherosclerotic processes)(20-22)。 4.兒茶素的分析方法 由於兒茶素被研究發現具有多種的生理活性,例如;抗氧化、抗癌和抗突變等活性(1)。為了要評估兒茶素在生物體內的影響性,及了解兒茶素的在生物體內的代謝情形,兒茶素的分析研究也是相當重要的一環。 一般而言,兒茶素可利用高效液相層析法來測量其含量,2000年由H.M. Merken與G.R. Beecher(29)發表的文獻中,回顧以高效液相層析法來測量食品(水果、紅酒、綠茶、烏龍茶、紅茶)中兒茶素的含量,大部分的流動相為梯度沖提(gradient elution),大多使用碳18的層析管柱與紫外光偵測器(UV detector)。另外在2000年由J.J. Dalluge與B.C. Nelson(17)所發表的研究中提到,液相層析法或毛細管電泳法最常被用應在綠茶中兒茶素的分離、鑑定與定量上。在生物檢品中,兒茶素也多以高效液相層析法分析,但因兒茶素在鹼性下不安定且不耐熱,偵測生物檢品的濃度,需要有較低的偵測極限,雖然紫外光偵測器(UV detector)與陣列偵測器(Photodiode Array Detector)常被使用於兒茶素於生物檢品中的濃度分析,但易受到檢品中其他雜訊的干擾,專一性不夠,且僅能定量到微克濃度(μg/mL),敏感度不佳;當以靜脈注射25mg/kg的EC於動物體內為例,於1小時後其血中濃度已降到1μg/mL以下,故利用紫外光偵測器(UV detector)與陣列偵測器(Photodiode Array Detector)並不足以定量分析兒茶素在生物檢品中的濃度。J.J. Dalluge與B.C. Nelson建議以質譜儀(mass spectrometry)、電化學偵測器(electrochemical detector,ECD)、化學冷光偵測器(chemiluminescence detector)和螢光偵測器(fluorescence)為較佳的選擇。若要以紫外光偵測器分析,則有先做衍生反應,使其在高波長下偵測干擾較少(30)。 5.兒茶素的代謝 J.P.Spencer於2003年所發表的文獻中,以體外實驗的方式研究兒茶素在體內的可能代謝路徑,並對兒茶素的代謝途徑做了以下結論,兒茶素在小腸會藉由uridine 5’-diphosphoglucuronosyltransferase(UGT)進行gluronidation ,以及在肝臟與catechol-O- methyltransferase (COMT)進行O-methylation,且在大腸中會被腸內菌分解為小分子phenolic acid 及valerolactones(31)。 在2003年由J.D. Lambert與C.S. Yang所發表的回顧文獻中,亦提出相同的看法,同時在研究報告中指出,在不同種的生物體內在gluronidation的代謝情形並不相同,以EGCG與EGC為例,人與小鼠間的代謝情形要較人與大鼠間的代謝路徑相似(32, 33)。 在大鼠中口服EGCG後,在體內以methylation反應被代謝,其主要代謝產物包括3’-and 4’-O-methyl EC,4’-O-methyl ECG及4’,4”-di-O-methyl EGCG。在人體內,EGC主要由glucuronidation (57-71%), sulfation (23-36%)兩個代謝途徑代謝,約有3-13%以原形排除,另有少部份EGC代謝為4’- O-methyl EGC後排除。(32, 33) Figure3. Metabolic fate of tea catechins. J. D. Lambert et al.Cancer chemopreventive activity and bioavailability of tea and tea polyphenols. Mutat Res 523-524: 201-8 (2003) 二、EC的簡介 EC為茶多元酚的主要成分之一,其所含比例僅次於EGCG、EGC、EGC。EC廣範存在於植物及由植物所衍生的食物中,包括紅酒、綠茶、巧克力等(29)。目前已經有研究指出EC能顯著抑制膽鹼酯?,有抑制乳酸菌生長、降低大白鼠血清和肝臟中膽固醇的作用。對阿?(alloxan)引起的大鼠糖尿有預防作用(34)。以下就以EC的來源、物理化學性質、藥理作用與活性及其代謝過程方面一一詳述。 1.EC的來源 EC含於許多植物中,例如銀杏(銀杏科)、沙棗(胡頹子科)、草原老鸛草(牻牛兒苗科)、茶(山茶科)、拳蔘(蓼科)、越橘(杜鵑花科)、鵝絨委陵菜(薔薇科)、貫葉金絲桃(金絲桃科)、紅七葉槲(七葉槲樹科)、兒茶(豆科)、可可(梧桐科)。EC在綠茶中的含量最高(5%),其次為可可亞(2-3mg/g)。EC常會伴隨者C一起存在於植物中(34),其結構上的不同在於第三的碳位置上氫氧基的不同,(+)-catechin為3S,而(-)-epicatchin為3R。雖然僅此不同,其物化性質與藥理活性即有相當大的差異。EC可以有效降低血中低密度酯蛋白過氧化(35),而C則對肝臟之病變較為有效(36)。 2.EC的物理化學性質 EC的化學名為(2R,3R) - 2 - (3,4-Dihydroxyphenyl) -3,4- dihydro -1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol;(-)-cis-3,3',4',5,7 - Pentahydroxy flavane ,其相關物化性質如下: 結構式: 分子式:C15H14O6 分子量:290.27 熔點:242℃ UVmax:280nm,230nm 3.EC之藥理作用與活性 3.1.EC抗氧化即清除自由基的作用 EC有低還原電位,而具有抗氧化的作用,及在其化學結構上有多個氫氧基團,可與自由基反應而有清除自由基的能力,於2003年B. Frei et al(10)對茶中的多酚類成份的抗氧化能力做研究,並測量其還原電位以評估其抗氧化作用,所測得之ECGC、ECG、EC、CG的還原電位分別為430mV、430mV、570mV、550mV。認為茶中所含的多酚成分擁有低還原電位具有抗氧化的能力。 在2004年J.Z. Xu et al (37)對茶中兒茶素其抗氧化能活性影響的研究中,在體外實驗中利用thiobarbituric acid substances reactive (TBARS)、2,2 - diphenyl - 1 - picrylhydrazyl (DPPH)、ferric reducing - antioxidant power (FRAP),分別評估兒茶素對人體低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的抗氧化能力、清除自由基的能力及對抗鐵離子還原的抗氧化能力。EGCG、 GCG、 EGC、 ECG、 CG、 EC、 C於10及20μM 的濃度下即具有抗低密度脂蛋白氧化的作用。於抗DPPH所產生的自由基的研究中,不同種兒茶素於相同濃度下(5μM)可清除80-90%的自由基。在FRAP的抗氧化能力研究中,兒茶素濃度提高亦可增加其抗氧化能力。 另外在E.L. Da Silva(38)等人的研究報告,先口服方式投與EC於大鼠中,分別於投藥後1及6小時採血,檢測血漿的抗氧化能力,結果顯示口服投與EC後可增加大白鼠血液的抗氧化能力。 3.2.EC降低血中低密度脂蛋白作用 在I. Ikeda et al(39)利用體外實驗研究證實ECG、EGCG、CGG、CG可以降低膽固醇於micecelles的溶解度,可能因此影響膽固醇於體內的吸收,而對EC、C、GC、EGC的研究並未發現相同的結果,但是在動物實驗中,投與EC可以降低動物血液中的低密度脂蛋白的濃度。在K.H van het Hof(16)等學者所發表的研究報告中指出,每個人每天喝四杯綠茶(含有EC 5 %),可以有效降低血液中低密度脂蛋白的濃度,另外在J.H. Weisburger(35)所發表的文獻中,認為兒茶素中的EC對於抗LDL的氧化有較強的效果。 3.3.EC與金屬螯合的能力 EC為flavonoid的結構,flavonid在A.B.C三個環上均可與金屬產生螯合,其中的catechol結構對金屬的螯合能力最強,亦為與金屬螯合最主要的作用基團(10)。 3.4.EC的促進P-glycoprotein功能的作用 P-glycoprotein 在體內的分部相當的廣,對於特定的藥物在生體可用率與分布上有很明顯的影響,例如:抗癌藥、peptide。P-glycoprotein具有排除外來物質的作用,屬於身體的防禦機制之一。在E.J. Wang et al(40)的研究報告中發現,除了EC之外的兒茶素具有輕微抑制或不影響P-glycoprotein的作用,但在EC的研究中卻有不同的結果。學者推論EC可能會與P-glycoprotein於不同的binding site結合,而進一步促進P-glycoprotein功能與能力的作用。而像這樣的作用機轉可能與抗癌作用之間有相關性。促進P-glycoprotein的作用可免於細胞與組織受到外來物質的侵害。 3.5.EC抑制神經元細胞老化的作用 阿茲海?症(Alzheimer’s disease)主要是由於神經元細胞不正常老化所造成的疾病,目前並沒有治療的藥物,之所以有不正常的細胞老化,是因為腦部產生的amyloid β protein 於腦部堆積,造成細胞凋零死亡,amyloid β protein,存在於正常人與AZ的病人腦中,但在正常人中amyloid β protein會被分解掉不會在腦部堆積,而在AZ的病人腦中並不會被分解,會一直堆積在腦部並對腦部神經元產生傷害。在H.J. Heo與 C.Y. Lee於2005年所發表的研究(41),以體外細胞培養,利用 25μM的amyloid β protein 誘發細胞凋零,然後給與細胞EC(10-100μM),結果細胞的存活率增加,且當EC的濃度為100μM其細胞的存活率達100%。由此實驗可證明EC具有抗神經元老化的作用,對於因神經元老化而引發的疾病,如帕金森氏症、阿茲海默症等,具有高度的研究價值。 4.副作用與毒性 4.1.抑制COMT的作用 EC具有catechol的結構,在M. Nagai et al(42),以人類肝臟細胞進行體外研究,認為兒茶素對COMT有很強的競爭抑制的作用,EC主要抑制estrogens的O-methylation反應,抑制estrogen 形成2-hydroxyestradiol (2-OH-E2)、4-hydroxyestradiol (4-OH-E4)。有實驗報告認為,在具有catechol結構的estrogen具有基因毒性,在體內可藉由O-methylation去活化基因毒性。其代謝產物2-OH-E2可引發細胞凋零也具有抗癌、抑制血管增生的作用(43, 44)。當EC去抑制estrogen的代謝,體內的estrogen會上昇,在特定器官可能引發腫瘤的生成。 4.2.抑制對鐵的吸收 在之前已提到,EC具有catechol的結構,能夠與金屬離子螯合,在M. Nelson 與J. Poultert(45)所發表的文獻,回顧喝茶對鐵離子吸收的影響,喝茶會抑制對鐵的吸收,對於本身鐵質缺乏的人必需注意可能因喝茶而造成的鐵質缺乏。 5.EC的安定性研究 對於EC的安定性研究報告並不多見,文獻上都一致認為兒茶素在鹼性下及高溫下不安定,在2002年由Q.Y. Zhu et al(46)所發表的安定性報告針對EC的安定性有詳細的結果。將EC分別置於pH 2-9的範圍,於37℃研究EC的安定性,用以評估,當口服給與EC後於生體腸胃道中的安定性。顯示當pH值大於9時,EC會於數分鐘內快速降解,pH值在5-9的範圍下,pH值越低,其安定性愈好,且pH值在6以下EC即具有良好的安定性。 6.EC的藥物動力學研究 1997年由L. Chen et al(47)所發表的研究,將去咖啡因的綠茶(EGCG 1.8mg/kg EGC 1.4mg/kg EC 0.7mg/kg)以靜脈注射投與於大鼠中,依EC血中濃度變化,並以PCNONLIN評估,發現EC為二室分室藥物動力學模式,其排除半衰期為41.2±8.7分鐘、清除率為13.9±2.1mL/min/kg。並比較口服去咖啡因綠茶,得到EC之身體可用率為31.2%。並進一步就EC在各組織內的分佈做研究,發現EC在腎臟與小腸組織內有高的曲線下面積,因此認為EC是由腎臟及膽汁排除。 於Y. Cai et al(48)所發表的研究,將EGCG、EGC、EC各6000μg、1101μg、930μg混合後,以靜脈注射投與於大鼠中,將所之血中濃度關係,以WINNOLIN以非室模式分析,所得之排除半衰期為59.7±7.4分鐘、清除率為31.3±5.0 mL/min/kg。並探討以腹腔給藥方式,EC僅5.1%會受到肝臟代謝的影響,顯示EC之first pass effect影響不大。 另於M. Zhu et al(49)的研究報告,將EC分別以2.5、5、10、15mg/kg四個不同劑量以靜脈注射於大鼠,依所得之血中濃度與時間關係結果,以WINNOLIN做最適配適,發現EC為二室分室藥物動力學模式,所得之排除半衰期分為46.3±11.8、42.1±8.8、46.5±8.4、38.3±9.3分鐘、清除率分為16±2、31±3、40±8、33±7mL/min/kg。 M. Richelle et al(50)以口服巧克力40、80克(含 EC 80、160mg)的方式研究EC於人體內的藥物動力學,依所得之血中濃度與時間關係圖,認為口服EC為一室分室模式,所得之排除半衰期為1.87±0.36、2.31±0.66小時。 Table 1.Pharamcokinetic parameters for EC Species Specimen Administration Dose Cmax(ng/mL) T1/2 Tmax CL(mL/min/kg) B.A.(%) Referance Man plasma PO DGT1.5g(containign EC 75mg)3g (containign EC 150mg)4.5g(containign EC 225mg) 55±24189±51190±62 5.7±2.0 h3.4±1.1 h3.2±1.2 h 1.4±0.6h1.8±0.6h1.8±1.1h (51) Rat plasma IVPO DGT25mg(0.68mg)200mg (5.46mg) 685.4±90 30.1±3.7min41.2±8.7min 54.6±8.5min 13.6±0.013.9±2.1 31.2 (47) Rat plasma IV 2.5mg/kg5mg/kg10mg/kg15mg/kg 46.3±11.842.1±8.846.5±8.438.3±9.3 16±231±340±833±7 (49) Rat plasma IVIP 0.93mg1.05mg 59.7±7.4 31.3±5 94.9 (48) Human plasma PO 40g chocolate(80mg)80g chocolate(160mg) 103±29196±57 1.87±0.362.31±0.66 2.00±0.00hr2.57±0.50h (50) 7.EC的代謝與排除研究 EC在結構上有多個氫氧基,所以代謝作用主要是經由phase Ⅱ reactions(glucronidation、sulfation及O-methylation),在不同種的動物中其代謝情況亦不相同,於Vaidyananthan et al(52)於體外利用肝臟酵素研究人與大鼠的肝臟酵素對EC於glucronidation 與sulfation這兩個代謝途徑上的差異,發現EC於人的肝臟主要以sulfation的形式代謝,於大鼠的肝臟則是以glucuronidation的形式代謝(48, 52)。 除了於肝臟代謝外,亦會在小腸中被uridine 5’-diphospho glucuronosyltransferase (UGT)代謝、以及於大腸中被細菌降解。將EC以口服投與至大鼠體內,其代謝排除途徑如Figure 4.,於腸道產生glucronidation,並於肝臟由catechol-O-methyltransferase (COMT)、phenolsulfotransferase (PST)代謝後由腎臟排除。 Figure 4. Proposed scheme of possible metabolic fate of orally administered EC in rats. COMT,catechol-O-methyltransferase; GlcA, glucuronide moiety; Meth, methyl moiety; PST, phenolsulfotransferase; Sulf, sulfate moiety; UGT, uridine 5’-diphospho glucuronosyltransferase. M. K. Piskula et al. Accumulation of (-)-epicatechin metabolites in rat plasma after oral administration and distribution of conjugation enzymes in rat tissues. J Nutr 128: 1172-8 (1998) 8.(-)-Epicatechin(EC)與(+)-Catechin(C) EC常會伴隨者C一起存在於植物中,其結構上的不同在於第三的碳位置上氫氧基的不同,(+)-catechin為3S,而(-)-epicatchin為3R,但其活性與藥理作用不完全相同,EC與C均屬於類黃酮素(flavonoids),於結構上具有多個氫氧基,具有清除自由基的能力,於B環上的catechol結構可與金屬離子產生螯合;於楊明玉(53)的論文研究中提到,EC與C清除氫氧自由基的能力分別為41.7%、40.6%。於J.Z. Xu et al(37)所發表的研究報告中指出,在體外實驗中利用thiobarbituric acid substances reactive (TBARS)、2,2 - diphenyl - 1 - picrylhydrazyl (DPPH)、ferric reducing - antioxidant power (FRAP),分別評估EC與C對人體低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的抗氧化能力、清除自由基的能力及對抗鐵離子還原的抗氧化能力,結果發現EC對於對人體低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的抗氧化能力、清除自由基的能力較C強,在對抗鐵離子還原的抗氧化能力的比較上,兩者並無明顯的差異。 在藥理作用上的研究方面,EC主要是針對降低血中低密度脂蛋白以及如何預防心血管疾病發生為主,在C的部份主要是針對其肝臟的保護作用為主。雖然其作用機制均是由於具有抗氧化與清除自由基的能力所產生的,可是不論於體內或體外的研究,都能夠發現EC與C兩者間有顯著的差異。 在藥物動力學的研究上,於Lee et al(54)對C的藥物動力學研究與M. Zhu et al(55)所發表的EC的藥物動力學研究,顯示EC與C都是屬於二室的藥物動力學模式。於S. Baba et al(56)對兩者於大鼠體內的代謝研究指出EC與C於大鼠體內會產生 methylation 以及conjugation的代謝產物,其主要代謝產物為3’-O-(-)epicatechin-5- O-glucuronide、3’-O-(-)-epiccatechin-5- O-sulfate、3’-O-methyl-(-)- epiccatechin- 5-O- sulfate、3’-O-methyl-(+)- catechin -5-O-glucuronide。作者還提到口服投與EC與C,彼此之間會競爭吸收。而由此推論其吸收途徑可能相同。 比較於L. Chen et al(47)於研究所得EC之生體可用率為31%;於Lee et al(54)的研究得到C之生體可用率僅2%,而EC的藥理活性又比C大,表示EC據有較高的研究價值(47, 57)。 三、實驗目的 雖然兒茶素的結構相似,其物化性質與臨床藥理作用都不相同,目前主要的研究對象仍以EGCG為主,因為EGCG在綠茶中的含量最高,其抗氧化作用也最強(4, 10, 11)。對於ECGC的研究報告也已相當豐富,不過對其他類兒茶素的研究報告仍相當缺乏。於最近的研究顯示EC具有抗神經細胞老化的功能,對於因神經細胞老化而造成的阿茲海默症、巴金森氏症等疾病的治療研究上,實具潛力(41)。且於EC尚可降低血中低密度脂蛋白,可預防心血管疾病發生率(35, 38)。 EGCG雖然是綠茶中含量最豐富的多元酚成分,其結構上具有多個氫氧基團,於體外研究中,其抗氧化效果亦最強,然而於本實驗室已發表的論文研究中指出(58),口服EGCG的生體可用率僅有2.3%,而於L. Chen et al(47)所發表的報告中顯示,口服投與綠茶,測量血中EC濃度獲得其生體可用率可達31.2%,不過其研究僅給予單一劑量,於藥動學上的資料仍不完全,故本實驗室以家兔模擬建立一完整的藥物動力學資料,希望對EC的研究與發展有所助益。 另外EC與C於結構上的不同,對其藥物動力學的影響,亦是我們的研究重點。 第二章 研究材料與方法 一、實驗材料與儀器 1.實驗試藥 (-)-Epicatechin Sigma (英國) 試藥特級品 Caffeine Sigma (英國) 試藥特級品 Heparin Sigma (英國) 試藥特級品 Ethylene diaminete tracetic BDH (英國) 試藥特級品 acid disodium salt (EDTA) Acetonitrile (CH3CN) Merck (德國) HPLC級 Methanol (MeOH) Merck (德國) HPLC級 Phosphoric acid (H3PO4) Merck (德國) 分析級試藥 Sodium hydroxide (NaOH) Nacalaitesque (日本) 試藥特級品 2.儀器 高效液相層析儀(High Performance Liquid Chromatographer,HPLC) 幫浦 (Pump) Shimadzu LC-10AD 檢測器 (Detector) Shimadzu RF-551 檢品自動注射器(Autoinjector) Shimadzu SLA-9A 積分器 (Integrator) EZ chrom Chromatography Data System 高速離心機 (Centrifuge) Heraeus D-37520 酸鹼測定器 (pH meter) Suntex 2000A 混合振盪器 (Vortexer) VWR multi-tube Vortexer 震盪水浴鍋(Water Bath Incubator) Yamato BT-25 3.試藥之配製 3.1.EC儲備溶液之配製 精秤EC 8mg置於10mL定量瓶中,以0.5mL的methanol溶液溶解後,以pH=3之緩衝溶液稀釋至定容,使成為0.8mg/mL之儲備溶液A。取儲備溶液A 0.25、0.5、1mL,分別置於10mL之定量瓶中,以pH=3之緩衝溶液稀釋至定容,使成為20、40、80μg/mL之儲備溶液B、C、D。取儲備溶液 B、C、D各1mL,分別置於10mL之定量瓶,以pH=3之緩衝溶液稀釋至定容,使成為2、4、8μg/mL之儲備溶液E、F、G。取儲備溶液B、C、D各0.1mL,分別置於10mL之定量瓶,以pH=3之緩衝溶液釋至定容,使成為0.2、0.4、0.8μg/mL之儲備溶液H、I、J。 3.2 Caffeine儲備溶液之配製 精秤Caffeine 5mg,置於100mL之定量瓶,以acetonitrile溶液溶解後稀釋至定容,使成為50μg/mL之caffeine儲備溶液K,作為血漿檢品的內部標準溶液。 3.3 磷酸溶液之配製 吸取85%磷酸溶液2.94mL,置於25mL之定量瓶,以去離子水溶解後稀釋至定容,使成為10% (v/v)之磷酸標準溶液。 二、實驗方法 1.分析條件 (-)-Epicatechin之分析條件如 Scheme 1.所示: HPLC幫浦:Shimadzu LC-10AD 層析管柱:Biosil 5 ODS 4.6 x 150mm 移動相:12%乙晴(acetonitrile),含35mM磷酸,以氫氧化鈉調整 pH值至pH=2.5,經0.45微米孔徑濾膜過濾,及超音波 除氣(degas)後使用。 流速:每分鐘1mL 偵測器:Shimadzu RF-551螢光偵測器 波長:激發波長固定在280nm,發射波長則固定在310nm 自動注入器:Shimadzu SIL-9A 積分器:EZchrom Chromatography Data System Scheme 1. HPLC analytical conditions for (-)-epicatechin Pump:Shimadzu LC-10AD Column:Biosil5 ODS 4.6x150mm Mobilephase:12% Acetonitrile containing 35mM phosphoric acid,adjust to pH=2.5 with sodium hydroxide solution Flow rate:1.0mL/min Detector:Shimadzu RF-551 Wavelength:Excitation at 280nm, emission at 310nm Autoinjector::Shimadzu SIL-9A Integrator:EZchrom Chromatography Data System 2.檢品之處理 處理步驟如Scheme 2.所示,將採得之兔血檢品1mL,於4℃,經13000rpm離心,分離出血漿,取血漿200μL,加入磷酸標準溶液(10%)10μL,再加入含有內部標準品caffeine儲備溶液K 600μL,強力振盪混合後,於4℃,經13,000rpm離心10分鐘,取上清液,以氮氣吹乾,再以200μL移動相溶液回溶,作為HPLC之檢品。 Scheme 2. Sample preparation for (-)-epicatechin ↓Take 200μL of rabbit plasma ↓add 10μL of phosphoric acid (10%) ↓Add 600μL of CH3CN (containing 30μg caffeine as internal standard) ↓Vortex for 1 min ↓Centrifuge at 4℃ for 10min at 13,000rpm ↓Transfer the supernatant into another tube ↓Evaporate to dryness under nitrogen gas ↓Reconstitute the residues with 200μL mobile phase solution ↓Vortex for 1min ↓Inject 50μL of the sample onto HPLC 3.標準檢量線之製作 取未給藥家兔之空白血漿(blank plasma) 200μL,分別加入EC之儲備溶液B、C、D、E、F、G、H、I、J各20μL,則使成為0.02、0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、2、4、8μg/mL EC之標準檢品,再加入600μL之caffeine儲備溶液K,再依前述“血漿檢品之處理”所載之方法處理,做成HPLC檢測之標準檢品,每次打入50μL,經HPLC檢測分析後,以EC與caffeine之波峰下高度比值與EC的濃度作迴歸,所得之線性迴歸線(linear regression line)即為其檢量線,作為檢量校正之用。每回定量檢品時,均確實重新建立該回之檢量線。 4.分析方法之確效試驗 4.1回內分析(within-run assay)之精確性(precision)與準確性(accuracy) 每回各取空白血漿(blank plasma) 200μL,分別加入EC儲備溶液,使其成為0.02、0.06、0.6、6μg/mL之EC確效檢品,以此四個濃度為一組,共準備六組,並同時製作一組標準檢量線來標定檢品中EC濃度,計算六組的結果平均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、及變異係數(C.V.%)。此分析之結果,用以確認回內血漿檢品分析方法之精確性(precision)與準確性(accuracy)。 4.2回間分析(between-run assay)之精確性(precision)與準確性(accuracy) 各回間取空白血漿(blank plasma) 200μL,分別加入EC儲備溶液,使其成為0.02、0.06、0.6、6μg/mL之EC確效檢品,以此四個濃度為一組,各回準備二組,並以每回製作之一組標準檢量線來標定檢品中EC濃度,此步驟在不同日內共執行六回,每回均將HPLC儀器重新開機。共取全部十二組的結果並計算其平均值(Mean)、標準偏差(S.D.)、及變異係數(C.V.%)。此分析之結果,用以確認回間血漿檢品分析方法之精確性(precision)與準確性(accuracy)。 4.3回收率試驗(recovery test) 取未給藥家兔之空白血漿(blank plasma) 200μL,分別加入EC儲備溶液,使成為0.02、0.06、0.6、6μg/mL EC之檢品,各準備3組,作為回收率試驗(recovery test)的檢品,檢品處理與前“檢品之處理”所述之方法相似,唯內部標準品caffeine溶液是在最後注入HPLC之前加入,當作外部標準品(external standard)混合而成經處理檢品(treated sample)。另取移動相溶液200μL,分別加入EC儲備溶液,使其成為0.02、0.06、0.6、6μg/mL EC之溶液,同一濃度亦準備3組,再加入caffeine混合而成未處理檢品(untreated sample)。將兩種檢品進行HPLC分析,比較二者波峰高度比(peak height ratio)用以計算回收率。 5.安定性試驗 5.1不同溫度下於血液中之安定性 進行實驗時分成二組,分別量取空白血液8mL,加入0.8mL EC儲備溶液A (800μg/mL)溶液混合均勻,將其分別置於室溫(25℃)下及冰浴(0℃)下作比較;各於適當時間採取血液檢品0.5mL,檢品依“檢品之處理”中之檢品處理方法製備後,注入HPLC 50μL,用以分析EC之經時殘存量。 5.2不同溫度下於血漿中之安定性 進行實驗時分成二組,分別量取空白血漿8mL,加入0.8mL EC儲備溶液A (800μg/mL)混合均勻,將其分別置於室溫(25℃)下及冰浴(0℃)下作比較;各於適當時間採取血漿檢品0.2mL,檢品依“檢品之處理”中之檢品處理方法製備後,注入HPLC 50μL,用以分析EC之經時殘存量。 5.3室溫下於已酸化之血漿中之安定性 進行實驗時,量取空白血漿8mL,加入加入0.8mL EC儲備溶液A (800μg/mL),再加入0.4mL磷酸標溶液(10%)均勻混合,置於室溫(25℃)下;在適當時間採取血漿檢品0.2mL,檢品依“檢品之處理”中之檢品處理方法製備後,注入HPLC 50μL,用以分析EC之經時殘存量。 6.動物實驗 6.1實驗家兔之準備 本實驗使用之家兔為雄性紐西蘭白兔(male New Zealand white rabbit)六隻,體重介於2.0~3.0 kg,自購入後經飼養兩週以上,才得進行實驗。投藥前至少禁食24小時以上,並抽取空白血漿(blank plasma)以作比對之用,投藥後12小時內限制飲食,但並不限制水份攝取,且二次實驗間的間隔至少七天。實驗中分析之血中藥物濃度,皆以當次之檢量線校正之。採血所用之針頭、針筒以及檢品容器均先經500I.U. heparin/mL加上2.5mg EDTA之溶液潤濕,以防止凝血現象發生。 6.2藥物投與溶液之組成 注射溶液之組成: 依家兔重量,稱取適當的EC,置於試藥瓶中,以2mL 50% alcohol溶解,成為注射液。 口服溶液之組成: 依家兔重量,稱取適當的EC,置於試藥瓶中,加入50mL去離子水,混合均勻成為口服懸浮溶液。 6.3靜脈注射EC之藥物動力學實驗方法 將家兔固定在限制籠內,於耳靜脈注入5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg,之EC注射溶液2mL,在注射後3、6、9、15、30、45、60、80、100、120、150、180、240、300分鐘,於另一耳內側靜脈採血,每次採血1mL,採得之血液檢品立即置入0℃冰浴中,溫度控制於4℃以13,000rpm在高速離心完畢,取上層血漿,以10%磷酸標準溶液酸化,並放入-80℃冰箱中儲存直到檢品分析。檢品依“檢品之處理”中之檢品處理方法製備後,以HPLC分析,可得到投與藥物在血中經時濃度變化,用以解析EC靜脈注射之藥物動力學特性。 6.4腹腔注射EC之藥物動力學實驗方法 將家兔固定在限制籠內,於腹腔注入25mg/kg之EC注射溶液2mL,在注射後3、6、9、15、30、45、60、80、100、120、150、180、240、300分鐘,於耳內側靜脈採血,每次採血1mL,採得之血液檢品立即置入0℃冰浴中,溫度控制於4℃以13,000rpm在高速離心完畢,取上層血漿,以10%磷酸標準溶液酸化,並放入-80℃冰箱中儲存直到檢品分析。檢品依“檢品之處理”中之檢品處理方法製備後,以HPLC分析,可得到投與藥物在血中經時濃度變化,用以解析EC腹腔注射之藥物動力學特性。 6.5口服投與EC之藥物動力學實驗方法 以胃管的方式投與家兔50mg/kg之EC口服懸浮液50mL,並隨即再給予30mL去離子水,再將之固定在限制籠中,在投藥後3、6、9、15、30、45、60、80、100、120、150、180、240、300分鐘,於耳靜脈採血,每次採血1mL,採得之血液檢品立即置入0℃冰浴中,溫度控制於4℃以13,000rpm在高速離心完畢,取上層血漿,以10%磷酸標準溶液酸化,並放入-80℃冰箱中儲存直到檢品分析。檢品依“檢品之處理”中之檢品處理方法製備後,以HPLC分析,可得到投與藥物在血中經時濃度變化,用以解析EC口服之藥物動力學特性。 7.動物實驗數據之處理 7.1靜脈注射EC之數據處理 由動物試驗所得之檢品分析結果中,EC濃度與時間的關係曲線,以電腦程式PKCALC?運算處理後,先得到藥物的起始動力學參數(initial parameters),如A、B、α、β,再利用電腦程式WINONLIN配合最適當的室性模式,代入PKCALC?之起始參數,並在不同的加權指數(weighting) 0,-1,-2下,作最精確的曲線配適(curve fitting),以得到最適切的藥物動力學參數。 對於各個不同靜脈投與劑量下(5、10、25mg/kg)所得之EC藥物動力學參數,如α-halflife (α-HL)、elimination half-life (T1/2)、K10、K12、K21、volume of distribution (V)、clearance (CL)、steady-state volume (Vss)等,是否存在差異性,以變異係數分析(analysis of variance;two-way ANOVA)作統計上的檢定(statistical test),並比較AUC與劑量之間的關聯性。 7.2腹膜腔投與EC之數據處理 分析腹膜腔投藥所得檢品中EC之濃度數據,同靜脈注射之數據處裡方法,先經PKCALC?運算處理之後,得到藥物動力學起始動力學參數(initial parameters),如A、B、α、β,再利用電腦程式WINONLIN配合最適當的室性模式,代入PKCALC?之起始參數,並在不同的加權指數(weighting) 0,-1,-2下,作最精確的曲線配適(curve fitting),以得到最適切的藥物動力學參數。 對於腹膜腔投藥所得之EC藥物動力學參數,如α-halflife (α-HL)、elimination half-life (T1/2)、K10、K12、K21、volume of distribution (V)、clearance (CL)、steady-state volume (Vss)等是否與靜脈投藥有差異性,以變異係數分析(analysis of variance;two-way ANOVA)作統計上的檢定(statistical test)。 7.3口服投與EC之數據處理 分析口服投藥所得檢品中EC之濃度數據,利用電腦程式WINONLIN配合非室性模式,作最精確的曲線配適(curve fitting),以得到最適切的藥物動力學參數。 7.4 腹膜腔內投與和口服投與EC之生體可用率的探討 腹膜腔內投與和口服投與EC,期生體可用率可依下列公式計算: 若藥物之排除符合線性藥物動力學(linear pharmacokinetic)之性質則 F:藥物之吸收分率 D:藥物之劑量 V:藥物之分布體積 K:藥物之排除速率常數 CL:藥物之清除率 絕對生體可用率可由下式求得 第三章 結果與討論 一、分析方法之結果與討論 研究報告中曾經使用於分析EC的分析方法有光譜測定法(Spectrophotometry)、紙層析法(Paper chromatography)、薄層層析法(Thin-layer chromatography)、氣相層析法(gas chromatography)、高效液相層析法(High performance liquid chromatography、HPLC)、毛細管電泳分析法(Capillary electrophoresis、CE),其中以HPLC最常被應用於生物檢品中EC濃度的分析。 本實驗的分析方法,如Scheme 1.所示,利用逆向層析管柱,配合螢光偵測器,激發波長(excitation wavelength)定於280nm,發射波長(emission wavelength)定於310nm,可有效減少生物檢品中的干擾,並增加分析時之靈敏度,以準確定量生物檢品EC之濃度。 利用HPLC之分析方法所得的圖譜如Figure 5.所示,EC的滯留時間為12.2分鐘,而內部標準品caffeine的滯留時間為6.8分鐘,並無干擾現象,分析之選擇性及解析度良好,在血漿檢品中EC之最低定量濃度可達20ng/mL,顯示此分析方法具有相當高的靈敏度與特異性(specificity),適合EC之生物檢品中微量藥物之定量分析。 Figure 5.HPLC chromatograms of (-)-epicatechin in rabbit plasma (A) Blank plasma (B) Plasma spiked with EC (LOQ, 20ng/ml) (C) Plasma sample taken at 45min after I.V. administration of 10mg/kg EC 1= caffeine (I.S.) at 6.8min;2= (-)-epicatechin at 12.2min (full scale 25mV) 1.分析方法之比較 Table 2. 是一些關於以HPLC分析EC於生物檢品中濃度研究報告的整理,其中包含分析管柱的種類、廠牌的選擇、偵測器的選擇,移動相的組成、流速設定及最低可定量濃度。 以下將針對本實驗室所採行的分析條件和其他研究報告所提出的分析條件作比較。 相較於L. Chen et al(47)所發表的研究報告,使用C18的逆相層析管柱,並採用階梯沖提(gradient elution)的方式分析,於此分析條件下EC的滯留時間為26分鐘,所需的分析時間較長,而本實驗所採用單一組成的移動相分析法,於分析所需的時間較短為一較省時的分析方法。 E.L. Da Silva et al(38)則採用單一組成的移動相,以78%的甲醇(MeOH)為移動相,流速控制在每分鐘0.9mL,並利用外部標準品來校正分析上的誤差,此分析方法中EC的滯留時間為10分鐘,而報告中並未提供分析圖譜及最低可定量濃度,故無從得知EC在此分析條件下是否會被其他雜訊干擾,也無從評估其分析靈敏度,且此分析方法採用外部標準品來校正檢品於定量分析時的誤差,其準確度可能較本實驗以內部標準品來校正檢品於分析上誤差要來的差。故本實驗不採用此分析方法。 由Y. Cai et al(48)所發表的研究報告,其檢品乃是採用液-液抽提法萃取,以乙酸乙酯(ethyl acetate)重複萃取二次,回收率差,不到50%,故本實驗室並不採用。 於H. Tsuchiya et al(59)所發表的研究報告,使用C8的層析管柱,以乙晴(acetonitrile):三氟醋酸(trifluoroacetic acid):水(water)=16.5:0.2:83.3為移動相,配合螢光偵測器,激發波長與發射波長分別定在282nm及314nm,管柱溫度控制在50℃,得到EC的滯留時間為7分鐘,最低可定量濃度(LOQ)為7.5ng/mL。本實驗室亦曾將管柱控溫在40℃的高溫下分析,將管柱溫度升高的確可以減少分析檢品所需的時間,但此分析方法會使管柱中的silica base溶解,且會破壞管柱中silca base 與碳鏈的鍵結,使得分離能力下降,快速減短管柱的使用壽命。且所提供之檢品處理方法複雜,在檢品處理過程中加入Diphenylbroate與EC形成離子錯合物,再將Diphjenylbroate-EC的錯合物分離出來,再純化出EC以供分析。而相較於本實驗所開發的方法,於室溫下分析,不會快速縮短管柱的壽命,且檢品處理步驟簡單,僅需以乙晴(acetonitrile)除蛋白,可減少於檢品處理上的困難性。 除了使用H. Tsuchiya et al(59)所發表的檢品處理方法外,於Richelle et al(50)所發表的研究,其檢品處理步驟是依Y. Ho et al(57)所發表的固-液抽提法(solid-liquid extraction),利用氧化鋁(aluminum oxide)對於含有catechol類的物質具有相當特異性的螯合作用,來做為固-液抽提的材料,以減少血漿中不必要之干擾物質,但處理過後的檢品回收率僅65%,而本實驗所用之檢品處理方法,平均回收率達87%。本實驗的檢品處理方法簡單且具有較佳的檢品回收率。 在Y. Miura et al(15)所發表的研究中,其移動相為乙晴(acetonitrile):乙酸乙酯(ethylacetate):磷酸緩衝溶液(phosphate buffer)=12:0.6:90,流速每分鐘0.8mL,推測其分析時間應較本實驗之分析時間長,且其檢品處理方式中使用液-液抽提法,其檢品回收率勢必會相當低,將無法得到較低的最低可定量濃度(LOQ)。故本實驗所採用的分析方法仍為一較佳的分析法。 雖然紫外光偵測器可用於分析生物檢品中EC的濃度,但於M. Zhu et al(49)所發表的研究,利用梯度沖提,配合紫光偵測器波長設定在278nm,來偵測血漿檢品中EC的濃度,欲在此較高的紫外波長下偵測,使較少的干擾被偵測到,但是以紫外光偵測器來分析生物檢品的靈敏度本來就較電化學偵測器或螢光偵測器差,此方法其最低可定量濃度(LOQ)為200ng/mL,相較本實驗使用螢光偵測器,其最低可定量濃度(LOQ)可達20ng/mL。應用本實驗室提供之分析方法可穫得較佳的分析靈敏度與專一性。 J.Z. Xu et al(37)亦使用紫外光偵測器來定量檢品中EC的含量,使用C18(Hypersil ODS 250X4.6mm)的逆向層析管柱,並採用梯度形式的移動相,(前28分鐘為乙晴(acetonitrile):2% 醋酸(acetic acid)=8:92,28至80分鐘為乙晴(acetonitrile):2% 醋酸(acetic acid)=27:73,80-85分鐘為乙晴(acetonitrile):2% 醋酸(acetic acid)=8:92),佐以流速每分鐘1mL,配合紫外光偵測器分析,報告中並未提供其滯留時間與最低可定量濃度(LOQ),由之前其他學者的分析條件推論此分析方法前28分鐘使用8%的乙晴(acetonitrile)為移動相,其沖提時間應會延長,且此分析條件使用紫外光偵測器,無法得到較低的最低可偵測濃度(LOQ)。分析時間長且靈敏度不佳,故本實驗的分析方法仍為一較佳的分析法。 另外於Y. Takizawa et al(60)所發表的研究報告,利用單一組成的移動相0.2% v/v磷酸(H3PO4):甲醇(MeOH):乙晴(acetonitrile)=500:90:25,流速設定在每分鐘1mL,並將管柱控溫於40℃,佐以電化學偵測器(ECD),得到EC之滯留時間為6分鐘,最低可定量濃度(LOQ)為5ng/mL,但於其分析圖譜中發現,EC有受到其他波峰干擾之虞,分離度並不好,且也有檢品處理步驟複雜之問題,故本實驗並不採用此分析方法。 於分析上可使用電化學偵測器或螢光偵測器以得到較佳的靈敏度,亦可使用質譜儀來定量生物檢品中的EC,於S. Baba et al(56)所發表的研究報告,採用梯度沖提,並配合質譜儀(mass spectormetry)分析,由於使用質譜儀為偵測器,可得到之最低可定量濃度應較本實驗室所開發之分析方法為低,此分析方法得到EC的滯留時間為11分鐘,相較於本實驗EC的滯留時間為12.2分鐘,僅節省1.2分鐘,若以分析成本作為考量,仍以本實驗室所開的分析方法為較佳選擇。 比較以上的分析方法,本實驗室所提供的分析條件有以下優點,移動相為單一組成,有著容易操作,所得EC的滯留時間為12.2分鐘,其分析時間長度適當,利用螢光偵測器具有良好專一性,於分析時無干擾影響的問題,適用於生物檢品的分析,且所得最低可定量濃度(LOQ)僅20ng/mL具有良好的分析靈敏度,以及檢品處理回收率高,且檢品處理方法簡單。 Table 2.HPLC analytical method for EC in plasma. Column Mobile phase A Mobile phase B Specimen Flow rate(mL/min) Temperature(℃) Detector LOQ(ng/mL) Retention time(min) Referance NBS C18 column 150x4.6mm 5μm 30mM Na2H2PO4 2.37%acetonitrile0.12% tetrahydrofuranpH=3.35 30mM Na2H2PO4 40%acetonitrile 6.65% tetrahydrofuran pH=3.45 Rat plasma 1 35 ECD 1 25 (47) TSKgel ODS-80TS 150X4.6mm 5μm 78% methanol20% water2% acetic acid50mM lithium acetate   Rat plasma 0.9 ECD 10 (38) Shim-pack CLC-C8(M) 250x4.6mm 5μm 16.5% acetonitrile0.2% trifluoroacetic acid83.3% water 16.5:0.2:83.3   Human plasma 1 50 FLex 282nmem 314nm 7.5 7 (59) Nova-Pak RP-C18 300x4.6mm 5μm 95.45% water4.5% acetonitrile0.05% H3PO4 49.95% water50% acetonitrile0.05% H3PO4 Rat plasma 1 32 FLex 280nm em 310nm 2 (50) BeckmanRP-ODS column 250x.6mm 5μm 0.4 M Na2H2PO4 5% acetonitrile( pH=2.4) 0.4 M Na2H2PO4 25% acetonitrile (pH=2.4) Rat plasma 1 UV278nm 200 (37) Capecellpak C18 AG column 100x4.6mm 0.2% H3PO4/methol/acetonitrile 500:90:25 v/v/v   Rat plasma 0.8 30 ECD 5 (15) Deverosil ODS-HG-5 250X20mm 5μm Methanol 8.32mM acetic acid Rat plasma 1 25 mass 11 (56) Capecellpak C18 UG column 250x4.6mm acetonitrile/ethylacetate/phosphate buffer(NaH2PO4 2H2O pH=4.9) 12:0.6:90   Rat plasma 1 40 ECD 5 (60) Hypersil ODS 250X4.6mm 5μm water containing 2% acetic acid acetonitrile Human plasma 1 UV280nm (37) Supelcosil C18 150x4.6mm 5μm 98.13% 30mM Na2H2PO41.75% acetonitrile0.12% tetrahydrofuran pH=3.35 41.5% 15mM Na2H2PO458.5% acetonitrile12.5% tetrahydrofuran pH=3.45 Rat plasma 1 35 ECD (48) 2.分析方法之標準檢量線 本實驗製作之EC血漿檢品標準檢量線濃度範圍介於20ng/mL-8000ng/mL之間,濃度與波線高度比之濃度迴歸,得其結果,直線迴歸方程式為Y=0.0013X+0.0291 R2=0.9986,如Figure 5.所示。各濃度的變異係數(C.V.)、標準誤差值皆小於9%,如Table 3.所示,得此良好之標準檢量線,可準確定量血漿檢品中EC的濃度。 3.分析方法之確效 本實驗室所使用之HPLC的分析方法具有良好之再現性(reproducibility),回內分析(within-run assay)與回間分析(between-run assay)之精確性與準確性試驗之變異係數(C.V.)皆小於15%,且濃度檢品定量的誤差百分比也小於15%,如Table 4.及Table 5.所示,由此可知本實驗的分析方法不僅具有良好之再現性,也提供極佳的精準性與準確性,對於血漿中的EC之濃度可達到精準的定量分析。 4.分析方法之回收率 血漿檢品處理以乙晴(acetonitrile)使其蛋白變性,達到除蛋白的效果,實驗結果顯示,平均回收率達87%,結果如Table 6.所示,顯示本實驗之血漿檢品處理方法提供良好的回收率。 Figure 6.Standard curve of EC in plasma (n=6) Table 3. Precision and accuracy of standard curve of EC (n=6) Spikedconcentration(ng/mL) Calculatedconcentration(ng/mL)a C.V. (%) Error (%) 20 20.48±0.02 1.17 2.42 40 41.13±3.63 8.83 2.83 80 78.15±2.60 3.33 -2.31 200 201.27±3.98 1.98 0.63 400 402.91±5.91 1.47 0.79 800 802.30±9.59 1.2 0.26 2000 2042.5±10.78 0.53 2.12 4000 4047.9±40.24 0.99 1.2 8000 7912.4±178.95 2.26 -1.1 aMean ±S.D. Table 4. Between-run precision and accuracy of EC (n=6) Spikedconcentration(ng/mL) Calculatedconcentration(ng/mL)a C.V. (%) Error (%) 20 17.35±0.53 3.07 -13.25 60 54.36±2.21 4.09 -9.4 600 554.16±22.36 4.04 -7.64 6000 5924.80±1079.50 1.82 -1.25 aMean ±S.D. Table 5. Within-run precision and accuracy of EC (n=6) Spikedconcentration(ng/mL) Calculatedconcentration(ng/mL)a C.V. (%) Error (%) 20 20.99±1.80 8.56 4.96 60 60.19±2.70 4.65 0.31 600 593.13±10.54 1.78 -1.15 6000 5972.90±130.34 2.18 -0.45 aMean ±S.D. Table 6.Recovery of EC (n=3) Spikedconcentration(ng/mL) Recovery (%)a C.V. (%) 20 87.35±0.00 7.36 60 86.03±0.00 2.24 600 87.85±0.01 1.75 6000 87.21±0.10 1.31 Mean 87.11±0.03 3.16 aMean ±S.D. 二、安定性試驗之結果與討論 由文獻EC的安定性研究報告得知,EC在pH值大於6.0會產生降解,此實驗僅對於緩衝溶液中pH值的不同對EC的安定性做探討,在生物檢品中的安定性仍未建立,且兔血漿的pH值約為7.4,有必要先確立EC於生物檢品中的安定性(46)。 1.EC在不同溫度下於血液中之安定性之結果與討論 將EC製備於兔全血中且存放於不同溫度(0℃、25℃)下,並在適當時間下取檢品,檢品依“檢品之處理”中之檢品處理方法製備後,觀察其安定性,實驗結果可知,EC在25℃下於全血中的降解十分快速,半衰期為5.76小時,在0℃下於全血中亦不安定,半衰期為13.42小時,且在全血中的安定性比在血漿中的安定性要來的差,與文獻所記載在緩衝溶液中pH=7.4的安定性相比,在生物檢品中EC有較差的安定性。將EC的全血與血漿檢品置於0℃下,降解速率明顯降低。由此推論,EC在兔全血與血漿中之降解速率可能不只是因為氫氧根離子催化的影響,還包括兔全血及血漿中酵素的影響。而將檢品置於冰浴中,可降低酵素的活性,也有助於EC於檢品中的安定。 2.EC在室溫下於已酸化之血漿中之安定性之結果與討論 已有文獻指出EC在低酸鹼值下有較佳的安定性,在酸化血漿檢品的實驗中也的確看到,於室溫下,經酸化的血漿檢品的降解速率明顯比未酸化的血漿檢品較慢,即表示經過酸化的處理有較佳的安定性(46)。 由以上安定性試驗的結果,得知於動物實驗中,於採血後必須冰浴並於1小時內於低溫下離心完成,所得之血漿亦需馬上酸化完成,並於6小時內冷凍儲存。 Figure 7.Stability of EC in rabbit blood at different temperature (n=3) Figure 8.Stability of EC in rabbit plasma at different temperature (n=3) Figure 9.Stability of EC in acidic plasma at 25℃(n=3) Table 7. Degradation half-lives of EC Sample pH Temperture(℃) Half-life(h) blood   0 13.42     25 5.76 plasma   0 508.76     25 28.75 acidic plasma 3.5 25 81.19 n=3 三、動物實驗之結果與討論 1.靜脈注射不同劑量EC之探討 1.1靜脈注射不同劑量EC之藥物動力學結果 以靜脈注射投與三種不同劑量(5、10、25mg/kg)於六隻家兔,其經時血中濃度關係圖如Figure 10.所示,利用PKCALC?電腦程式處理其結果,選擇好的相關係數(R2>0.95),則發現EC屬於二室性藥物動力學模式。因此,再利用二室性動力學模式計算所得之起始藥物動力學參數(initial parameters) - A、B、α、β帶入電腦程式WINNOLIN program並在不同的加權指數(weighting)- 0、-1、-2下,進行更準確二室模式之曲線配適(curve fitting),以得到最適切的藥物動力學參數對於各個不同靜脈投與劑量下(5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg)所得之EC藥物動力學參數,結果如Table 8.Table 9. Table 10.所示。所得曲線下面積(AUC)分別為94.39±11.77、195.93±42.82、476.74±108.18μg?min/mL;分布半衰期(α-HL)分別為5.24±1.00、5.77±3.09、6.15±1.57分鐘;排除半衰期(T1/2)分別為51.16±6.42、51.72±5.15、49.99±10.96分鐘;分布體積(V)分別為604.36±101.75、580.79±252.06 666.38±173.50 mL/kg、;清除率(CL)分別為53.62±6.27、53.04±11.07、54.32±10.09mL/min/kg;穩定狀態分布體積(Vss)分別為1684.30±152.33、1470.03±240.32、1550.08±351.38mL/kg。 以two-way ANOVA分析此三個不同劑量下,各個參數之間的相關性及差異性,統計檢定之結果如Table 11.所示。在此劑量範圍下(5-25mg/mL),各項藥物動力學參數如α-halflife(α-HL)、elimination half-life (T1/2)、K10、K12、K21、volume of distribution(V)、clearance(CL)、steady steady volumn(Vss),area under the plasma concentration time curve(AUC)並無統計學上的差異(P>0.05)。 Figure 10.Plasma concentration of EC in rabbit after I.V. administration of EC at dose of 5, 10, 25 mg/kg (n=6) Table 8.Pharmacokinetic parameters of EC after I.V. administration of 5 mg/kg EC in rabbits (n=6) AUC α-HL T1/2 K10 K12 K21 V CL Vss No. Μg?min/mL min min min-1 min-1 min-1 mL/kg mL/min/kg mL/kg 1 90.98 6.20 51.39 0.0814 0.0254 0.0185 675.17 54.96 1600.11 2 93.17 3.94 49.81 0.1158 0.0530 0.0212 463.57 53.67 1625.01 3 114.27 5.05 50.11 0.0768 0.0495 0.0247 569.64 43.75 1710.93 4 100.96 4.19 53.65 0.0952 0.0608 0.0225 519.95 49.52 1926.87 5 82.28 5.96 60.93 0.0894 0.0235 0.0148 679.93 60.77 1759.23 6 84.66 6.11 41.10 0.0823 0.0248 0.0233 717.87 59.06 1483.64 Mean 94.39 5.24 51.16 0.0901 0.0395 0.0208 604.36 53.62 1684.30 S.D. 11.77 1.00 6.42 0.0141 0.0168 0.0036 101.75 6.27 152.33 Table 9.Pharmacokinetic parameters of EC after I.V. administration of 10 mg/kg EC in rabbits (n=6) AUC α-HL T1/2 K10 K12 K21 V CL Vss No. μg?min/mL min min min-1 min-1 min-1 mL/kg mL/min/kg mL/kg 1 162.47 3.65 59.46 0.1367 0.0487 0.0162 450.09 61.55 1804.37 2 164.68 6.63 48.22 0.0817 0.0188 0.0184 743.16 60.72 1503.00 3 242.48 5.33 44.72 0.0881 0.0345 0.0229 468.32 41.24 1175.02 4 250.50 3.95 55.00 0.0996 0.0661 0.0222 400.74 39.92 1595.21 5 152.57 3.46 51.89 0.1643 0.0330 0.0163 398.87 65.54 1207.45 6 202.87 11.57 51.02 0.0482 0.0084 0.0169 1023.58 49.29 1535.12 Mean 195.93 5.77 51.72 0.1031 0.0349 0.0188 580.79 53.04 1470.03 S.D. 42.82 3.09 5.15 0.0415 0.0206 0.0030 252.06 11.07 240.32 Table 10.Pharmacokinetic parameters of EC after I.V. administration of 25 mg/kg EC in rabbits (n=6) AUC α-HL T1/2 K10 K12 K21 V CL Vss No. μg?min/mL min min min-1 min-1 min-1 mL/kg mL/min/kg mL/kg 1 425.71 4.62 41.99 0.0991 0.0425 0.0250 592.52 58.73 1600.19 2 412.50 7.63 55.35 0.0689 0.0179 0.0165 879.85 60.61 1835.53 3 480.18 4.34 34.41 0.1054 0.0438 0.0305 493.80 52.06 1203.16 4 683.24 5.79 47.02 0.0785 0.0336 0.0225 466.27 36.59 1161.68 5 381.18 6.30 56.61 0.0802 0.0254 0.0168 818.22 65.59 2051.83 6 477.61 8.22 64.55 0.0700 0.0121 0.0129 747.63 52.34 1448.10 Mean 476.74 6.15 49.99 0.0837 0.0292 0.0207 666.38 54.32 1550.08 S.D. 108.18 1.57 10.96 0.0152 0.0130 0.0065 173.50 10.09 351.38 Table 11.Comparison the pharmacokinetic parameters of EC after I.V. administration EC in rabbits (n=6) DoseParameter 5mg/kg 10mg/kg 25mg/kg P AUC(μg?min/mL) 94.39±11.77 195.93±42.82 476.74±108.18 <0.001 α-HL(min) 5.24±1.00 5.77±3.09 6.15±1.57 0.7539 T1/2(min) 51.16±6.42 51.72±5.15 49.99±10.96 0.9282 K10(min-1) 0.0901±0.0141 0.1031±0.0415 0.0837±0.0152 0.4595 K12(min-1) 0.0395±0.0168 0.0349±0.0206 0.0292±0.0130 0.5979 K21(min-1) 0.0208±0.0036 0.0188±0.0030 0.0207±0.0065 0.7069 V(mL/kg) 604.36±101.75 580.79±252.06 666.38±173.50 0.7183 CL(mL/min/kg) 53.62±6.27 53.04±11.07 54.32±10.09 0.9726 Vss(mL/kg) 1684.30±152.33 1470.03±240.32 1550.08±351.38 0.3802 Data are expressed as Mean±S.D. 1.2靜脈注射不同劑量EC之藥物動力學討論 由靜脈注射之結果可知,投與EC5-25mg/kg之範圍內,家兔體內之藥物動力學狀態呈現線性關係,非依賴劑量的藥物動力學(dose-independent pharmacokinetics)。各個藥物動力學參數並不因劑量之改變而隨之變動,且曲線下面積(AUC)與劑量之關係圖亦成良好線性關係,如Figure 11.所示。(Y=2.005X-19.026 R2=0.9998 P<0.001) Figure 11.Correlation between dose of EC and AUC in rabbit plasma after I.V. administration of EC (n=6) 在已發表的文獻中與EC相關的藥物動力學研究中並無以家兔為實驗對象的報告,主要研究對象為大鼠。 本實驗投與EC於家兔後所得的經時血中濃度圖,利用PKCALC、WINNOLIN等電腦程式處理之結果,發現EC是屬於二室性藥物動力學模式,此結果與L. Chen et al、M. Zhu et al於大鼠體內所作之藥物動力學研究結果一致(47, 49)。 在L. Chen et al、M. Zhu et al所發表之研究中,使用同種的大鼠,所得之藥物動力學參數卻有明顯差異。L. Chen et al將去咖啡因的綠茶(EGCG 1.8mg/kg EGC 1.4mg/kg EC 0.7mg/kg)以靜脈注射投與於大鼠中,所得EC排除半衰期為41.2±8.7分鐘、清除率為13.9±2.1mL/min/kg。於M. Zhu et al的研究報告,將EC分別以2.5、5、10、15mg/kg四個不同劑量以靜脈注射投與於大鼠體內,所得EC之排除半衰期分為46.3±11.8、42.1±8.8、46.5±8.4、38.3±9.3分鐘、清除率分為16±2、31±3、40±8、33±7mL/min/kg(47, 49)。 在L. Chen et al(47)的實驗設計中,給予去咖啡因的綠茶,以靜脈注射投與混合物而得到之藥物動力學結果,並未考慮混合物中的交互作用,所得的藥物動力學參數可能並不正確。 於M. Zhu et al(49)所發表的文獻中有提到EGCG會因為茶中其他兒茶素成分的存在而改變其藥物動力學參數,所以M. Zhu et al對EGCG、EGC、EC的藥物動力學研究僅以單一成分投與於大鼠中,以求得最正確的藥物動力學之參數與結果。而在L. Chen et al的研究中,也以單一劑量之EGCG(10mg/kg),以靜脈注射至大鼠體內,所得之藥物動力學參數(K10為0.033±0.005min-1、K12為0.023±0.005min-1、K21為0.009±0.001、T1/2為135.1±12.3分鐘、CL為14.3±3.6mL/min/kg),與於同一實驗中以去咖啡因綠茶靜脈注射EGCG所得之藥物動力學參數不相同(K10為0.014±0.004min-1、K12為0.076±0.05
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